論藥品微生物檢測實驗室的建立論文

微生物污染是藥品質量評估的重要指標，目前各國藥典收錄的藥品無菌檢查和微生物限度檢查方法只對藥品終產品質量進行評價，且對無菌檢查不合格的藥品要求不得進行復驗。藥品微生物檢測實驗室如缺少對實驗環境的監督和控制，則無法評估微生物陽性結果的污染來源。而藥品檢測過程中的微生物陽性結果可能源於實驗過程中環境的污染，因此判斷檢出菌與環境菌的相關性，是排除實驗過程污染、減少假陽性結果、提高檢驗結果準確性的必不可少的環節。同時現階段藥品安全管理仍存在監管漏洞，當藥品受到致病微生物污染時，往往出現定溯源難、應變慢等問題。若建立微生物檢測實驗室日常的環境微生物菌庫，則可較好地解決上述問題。目前國外通過分子生物學手段對病原微生物建庫的研究較多，如RIDOM website 提供根據16S DNA 序列的差異建立的病原微生物庫[4]。國內對製藥環境建立環境微生物菌庫相關方面的研究也有報道，如PEI等[5]曾採用FTIR 法構建潔淨室環境菌的FTIR 譜庫，但該方法對微生物的培養條件及預處理要求嚴格，隨機誤差也較大。目前在藥品微生物檢測實驗室建立環境微生物菌庫方面的研究仍較少。本研究從筆者工作的藥品微生物檢測實驗室環境中不同部位、設備材料及活動人員進行連續7個月採樣收集微生物，共獲得248 株細菌和6 株黴菌，對收集的細菌採用全自動微生物生化鑑定儀(Vitek2 Compact)進行鑑定，對生化鑑定無確切結果的90 株細菌及6 株黴菌均採用3500 MicroSeq基因測序分析系統進行細菌16S rDNA 和黴菌LSU rDNA 測序鑑定，並對某次採樣收集獲得的6株金黃色葡萄球菌採用Diversilab 進行同源性分析。通過對鑑定結果的整理和分析，初步建立了藥品微生物檢測實驗室環境微生物庫，為今後本實驗室微生物檢測結果污染溯源調查提供了信息保障，同時也為製藥企業開展建立環境微生物信息庫和微生物污染溯源提供了技術指導。

　　1 材料與方法

1.1 儀器與試劑光學顯微鏡( 日本奧林巴斯) ; VITEK 2Compact 全自動微生物生化儀、全自動革蘭氏染色儀、Diversilab 同源性分析系統(法國梅里埃);梯度96 孔Verti PCR 儀(美國ABI 公司);PowerpacBasic 電泳儀(美國Bio-Rad 公司);3500 MicroSeq全自動微生物基因分析鑑定系統(美國ABI 公司)。

1.2 環境微生物的`收集連續7 個月對微生物實驗室環境中不同部位、活動人員及設備材料採用胰蛋白腖大豆瓊脂(廣東環凱)平板，分別通過接觸碟法(人員身上取樣)、浮游菌採樣器(環境浮游微生物取樣)、空氣沉降法(環境沉降微生物取樣)及棉籤擦拭法(設備和材料表面取樣)進行微生物樣本採集，分離純化後共獲得248 株細菌和6 株黴菌，採用甘油凍存管置?70 ℃冰箱保存。

1.3 生化鑑定採用VITEK 2 Compact 對獲得的248 株細菌的新鮮培養物根據革蘭染色鏡檢結果選取GN、GP、BCL 不同鑑定試劑卡進行生化鑑定。

1.4 細菌16S rDNA 及黴菌LSU rDNA 測序鑑定對VITEK 鑑定無確切鑑定結果的90 株細菌及6 株黴菌分別採用3500 MicroSeq 全自動微生物基因分析鑑定系統進行細菌16S rDNA 和黴菌LSU rDNA 測序鑑定。採用3500 MicroSeq 系統配套試劑對90 株細菌和6 株黴菌的TSA 平板培養物分別進行DNA 抽提、PCR 擴增和純化、標記反應及標記反應純化，最後進行毛細管電泳測序。

1.5 6 株金黃色葡萄球菌的Diversilab 同源性分析某次採樣收集到6 株菌，採用VITEK 生化鑑定和16S rDNA 測序鑑定結果均為金黃色葡萄球菌，且在所測16S rDNA 基因片段中序列完全相同。為進一步獲得6 株菌的分型信息，採用基於重複序列擴增技術的Diversilab 同源性分析系統進行實驗。對6 株菌分別採用DiversiLab 儀器配套的金黃色葡萄球菌的rep-PCR 擴增試劑盒先進行擴增，後吸取1 ?L PCR 產物加入芯片的標本孔，進行電泳分離擴增的DNA的片段，採用儀器自帶軟件繪製基因分型同源性關係圖。

　　2 結果

2.1 菌株來源統計本次建庫收集到環境微生物分離菌株共計254 株，包括248 株細菌和6 株黴菌，所有的黴菌均來源於沉降菌收集。大部分菌株均來源於在微生物實驗室活動的人員(137 株)，佔全部分離菌株的53.9%。其餘環境沉降微生物(30 株)、環境浮游微生物(47 株)及來源於設備和材料表面的微生物(40 株)佔全部分離菌株比例相差不大，分別為11.8%，18.5%和15.7%。

2.2 環境微生物菌庫的建立結合生化鑑定和測序鑑定結果的254 株微生物的鑑定結果統計見表1。其中葡萄球菌屬細菌最多，佔全部分離菌的34.3%;其次為芽孢桿菌和微球菌，分別佔全部分離菌的32.7%和12.6%。環境沉降菌和空氣浮游菌共收集到77 株微生物，佔污染微生物總數的30.3%。其中，芽孢桿菌、葡萄球菌和藤黃微球菌均為常見環境菌。從設備材料和操作人員共收集分離表面微生物177 株，佔污染微生物總數的69.7%。污染微生物比例最高的分別為芽孢桿菌屬、藤黃微球菌和表皮葡萄球菌，分別佔表面微生物總數的29.9%、15.8%和14.1%。採用生化鑑定和測序鑑定2 種方法對微生物實驗室環境中收集到的254 株菌進行鑑定，通過鑑定結果的整理和分析，初步建立了藥品微生物檢測實驗室環境微生物庫。

2.3 6 株金黃色葡萄球菌的同源性分析結果6 株金黃色葡萄球菌採用Diversilab 系統進行同源性分析，實驗結果顯示6 株金黃色葡萄球菌高度同源，最低菌株間的親緣關係也達到99%(親緣關係>95%，即為同源)，所以6 株菌應該來自同一個污染源。

　　3 討論

從建立的環境微生物庫各方面的對比情況分析可知，大部分微生物均來源於微生物實驗室中活動的人員。葡萄球菌屬和微球菌屬細菌為人體易攜帶污染的微生物，這兩類微生物在多個採樣點均有發現，所以可能是由於人員活動或表面接觸帶來的交叉污染，表明操作人員攜帶的微生物是實驗室環境菌的主要來源之一，為了減少污染應嚴格控制人員的更衣和清潔程序。環境中同樣存在着多種芽孢桿菌，在環境中不易被消毒滅菌，可能是由於消毒頻次和消毒劑效力問題導致的殘留污染，應該增加消毒滅菌頻率並有計劃地更換消毒劑確保杜絕污染。本研究通過7 個月的持續採樣收集環境微生物，初步建立了藥品微生物檢測實驗室的環境微生物庫，但是環境微生物庫的建立是個持續動態的過程，因此需要在日常監測中不斷完善。本次建庫採用微生物鑑定(生化鑑定和測序鑑定)和分型技術(Diversilab 同源性分析系統)對微生物實驗室進行監控，建立和健全了日常監督檢查方法，為今後開展污染水平的風險評估和不良事件調查提供技術平台，同時也為高風險藥品生產企業建立環境微生物數據庫提供技術指導。