關於微生物的生理生化反應

【目的要求】

1．證明不同微生物對各種有機物大分子物質的水解能力不同，從而説明不同微生物有着不同的酶系統。

2．掌握進行微生物大分子物質水解試驗的原理和方法。

3．瞭解糖發酵的原理和在腸細菌鑑定中的重要作用。

4．掌握通過糖發酵鑑別不同微生物的方法。

【基本原理】

1．微生物對大分子物質如澱粉、蛋白質和脂肪不能直接利用，必須依靠產生的胞外酶將大分子物質分解後，才能被微生物利用。胞外酶主要為水解酶，通過加水裂解大分子物質為較小化合物，使其能被運輸至細胞內。如澱粉酶水解澱粉為小分子的糊精、雙糖和單糖，脂肪酶水解脂肪為甘油和脂肪酸，蛋白酶水解蛋白質為氨基酸等，這些過程均可通過觀察細菌菌落周圍的物質變化來證實。如澱粉遇碘液會產生藍色，但細菌水解澱粉的區域，用碘液測定時，不再產生藍色，表明細菌產生澱粉酶。脂肪水解後產生脂肪酸可改變培養基的pH，使pH降低，加入培養基的中性紅指示劑會使培養基從淡紅色轉變為深紅色，説明細胞外存在脂肪酶。

2．糖發酵試驗是常用的鑑別微生物的生化反應，在腸道細菌的鑑定上尤為重要，絕大多數細菌都能利用糖類作為碳源，但是它們在分解糖類物質的能力上有很大的差異，有些細菌能分解某種糖產生有機酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（如氫氣、加完、二氧化碳等），有些細菌只產酸不產氣。例如，大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產酸併產氣；傷寒桿菌分解葡萄糖產酸不產氣，不能分解乳糖；普通變形桿菌能分解葡萄糖產酸產氣，不能分解乳糖。發酵培養基含有蛋白腖、指示劑（溴甲酚紫）、倒置的德漢氏小管和不同的'糖類。當發酵產酸時，溴甲酚紫指示劑可由紫色（pH6.8）轉變為黃色（pH5.2）。氣體的產生可由倒置的德漢氏小管中有無氣泡來證明。

3．IMViC是吲哚（indol）、甲基紅（methylredtest）、伏-普（Voges-Prokauertest）和檸檬酸鹽（citratetest）四個實驗的縮寫，主要用於快速鑑別大腸桿菌和產氣腸桿菌，多用於水細菌學檢查。硫化氫試驗也是檢查腸道桿菌的生化試驗。大腸桿菌雖非致病菌，但在飲用水中超過一定數量，則表示受糞便污染，產氣腸桿菌也廣泛存在於自然界中，因此檢查水時要將兩者分開。

吲哚試驗是用於檢測吲哚的產生，某些細菌可產生色氨酸酶，分解蛋白腖中的色氨酸產生吲哚和丙酮酸。對二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚（紅色）。但並非所有的微生物都具有分解色氨酸產生吲哚的能力，因此吲哚試驗可以作為一個生物化學檢測的指標。

色氨酸水解反應：

1

吲哚與對二甲基氨基苯甲醛反應：

大腸桿菌吲哚反應陽性，產氣腸桿菌為陰性。

4．甲基紅試驗是用來檢測由葡萄糖產生的有機酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。當細菌代謝糖產生酸時，培養基就會變酸，使加入培養基中的甲基紅指示劑由橙黃色（pH6.3）轉變為紅色（pH4.2），即甲基紅反應。儘管所有的腸道微生物都能發酵葡萄糖產生有機酸，但這個試驗在區分大腸桿菌和產氣腸桿菌上仍然是有價值的。這兩個細菌在培養的早期均產生有機酸，但大腸桿菌在培養後期仍能維持酸性pH4，而產氣腸桿菌則轉化有機酸為非酸性末端產物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大約6，因此，大腸桿菌為陽性，產氣腸桿菌為陰性。

【實驗器材】

1．菌種

枯草芽孢桿菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，普通變形桿菌，產氣腸桿菌。

2．培養基

固體油脂培養基，固體澱粉培養基，葡萄糖發酵培養基試管，乳糖培養基試管各3支（內裝有倒置的德漢氏小管），蛋白腖水培養基，葡萄糖蛋白腖水培養基。

3．溶液和試劑

盧戈氏碘液，甲基紅指示劑等。

4．儀器和其他用品

無菌平板，無菌試管，接種環，試管架等。

【操作步驟】

1．澱粉水解試驗

（1）將固體澱粉培養基溶化後冷卻至50℃左右，無菌操作製成平板。

（2）用記號筆在平板底部劃成4個部分。

（3）將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分別在

不同的部分點一下，在平板的反面分別在4個部分寫上菌名。

（4）將平板倒置在37℃温箱中培養24h。

（5）觀察各種細菌的生長情況，打開平板蓋子，滴入少量盧戈氏碘液於平

板中，輕輕旋轉平板，使碘液均勻鋪滿整個平板。

如菌苔周圍出現無色透明圈，説明澱粉已被水解，為陽性。根據透明圈的大小可初步判斷該菌水解澱粉能力的強弱，即產生胞外澱粉酶活力的高低。

2．油脂水解實驗

（1）將熔化的固體油脂培養基冷卻至50℃左右時，充分搖盪，使油脂均勻

分佈，無菌操作倒入平板，待凝。

（2）用記號筆在平板底部劃成4部分，分別在4部分表上菌名。

（3）用無菌操作將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單

胞菌分別劃十字線接種於平板的相對應部分的中心。

（4）將平板倒置，37℃温箱中培養24h。

（5）取出平板，觀察菌苔顏色。

如出現紅色斑點，説明脂肪水解，為陽性反應。

3．糖發酵試驗

（1）用記號筆在各試管外壁上分別標明發酵培養基的名稱和所接種的細菌

菌名。

（2）取葡萄糖發酵培養基試管3支，分別接入大腸桿菌、普通變形桿菌，

第三支不接種，作為對照。另取乳糖發酵培養基試管3支，同樣分別接入大腸桿菌、普通變形桿菌，第三支不接種，作為對照。

在接種後，輕緩搖動試管，使其均勻，防止倒置的小管進入氣泡。

（3）將接過種和作為對照的6支試管均置37℃中培養24~48h。

（4）觀察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無氣泡。

4．吲哚試驗

（1）將大腸桿菌、產氣腸桿菌分別接入2支蛋白腖水培養基中，置37℃培

養48h。

（2）向培養基內加入3~4滴乙醚，搖動數次，靜置1min，待乙醚上升後，

沿試管壁徐徐加入2滴吲哚試劑。在乙醚和培養物之間產生紅色環狀物為陽性反應。

5．甲基紅試驗

（1）將大腸桿菌、產氣腸桿菌分別接入2支葡萄糖蛋白腖水培養基中，置

37℃培養48h。

（2）將1支葡萄糖蛋白腖水培養基培養物內加入甲基紅試劑2滴，培養基

變為紅色者為陽性，變為黃色者為陰性。

【實驗結果】

1．表格

3

大腸桿菌（無透明圈）

金黃色葡萄球菌（無透明圈）

銅綠假單胞菌（形成透明圈）

枯草芽孢桿菌（形成透明圈）

圖一澱粉水解試驗

金黃色葡萄球菌（不變紅）

枯草芽孢桿菌（不變紅）

大腸桿菌（不變紅）

銅綠假單胞菌（紅色）

圖二油脂水解試驗

4

大腸桿菌分解葡萄糖（變黃，產生氣泡）

變形桿菌分解葡萄糖（變黃）

葡萄糖培養基空白對照組（紫色，無氣泡）

大腸桿菌分解乳糖（變黃，產生氣泡）

變形桿菌不能解乳糖（紫色，無氣泡）

乳糖培養基空白對照組（紫色，無氣泡）

圖三糖發酵試驗

大腸桿菌（未變紅,未得到預期結果）

產氣腸桿菌（未變紅）

圖四吲哚試驗（未得到預期結果）

產氣腸桿菌（變黃）

大腸桿菌（變紅）

圖五甲基紅試驗

吲哚試驗失敗分析：可能是乙醚加量太少，影響實驗現象的觀察

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