微生物學實驗講義

微生物學類實驗講義

(適用專業：生物工程、生物技術、生物科學)

北方民族大學生物科學與工程學院

2010年制定

1實驗目錄

微生物學實驗規則和安全……………………………………3

實驗一微生物學實驗基本知識與準備………………………………5

實驗二實驗三實驗四實驗五實驗六實驗七實驗八實驗九實驗十顯微鏡油鏡的使用與細菌染色…………………………………10

細菌芽孢、莢膜的染色及其認識………………………………17

顯微鏡測微技術及細菌運動性觀察……………………………19

酵母菌個體、羣體形態觀察，血球板顯微鏡計數技術…22

放線菌個體、羣體形態觀察……………………………………24

黴菌個體、羣體形態觀察………………………………………25

培養基的配製及濕熱滅菌，玻璃器皿的乾熱滅菌……………27

微生物的分離與純化……………………………………………31

理化因素對微生物生長的影響，生長譜法測定微生物營養要求……33

2微生物學實驗規則和安全

普通微生物學實驗課的目的是：訓練學生掌握微生物學最基本的操作技能，瞭解微生物學的基本知識，加深理解課堂講授的某些微生物學理論。同時，通過實驗，培養學生觀察、思考、提出問題、分析問題和解決問題的能力，實事求是、嚴肅認真的科學態度以及敢於創新的開拓精神；樹立勤儉節約、愛護公物的良好作風。

微生物學實驗室是一個嚴肅的實驗場所，雖然普通微生物學實驗所用的微生物材料一般為非致病菌或條件致病菌，但許多微生物是否具有致病性不是絕對的，與其數量、條件、感染途徑等有關，所以在實驗操作中，必須將所有的微生物培養物都看成是具有潛在致病性的。

3為了上好微生物學實驗課，並保證安全，特制定如下規則和安全措施：

1．每次實驗前必須對實驗內容進行充分預習，以瞭解實驗的目的、原理和方法，做到心中有數，思路清楚。

2．在整個實驗過程中必須穿上實驗服，留長髮者，必須將長髮挽在背後。實驗台上除了記錄本和筆(記錄筆和記號筆)以外，不準堆放任何個人物品。

3．認真及時做好實驗記錄，對於當時不能得到結果而需要連續觀察的實驗，則需記下每次觀察的現象和結果，以便分析。

4．實驗室內應保持整潔，勿高聲談話和隨便走動，保持室內安靜。

5．實驗時小心仔細，全部操作應嚴格按照操作規程進行，禁止用嘴吸取菌液或試劑，萬一遇有盛菌試管或瓶不慎打破、皮膚破傷等意外情況發生時，應立即報告指導教師，及時處理，切勿隱瞞。

6．實驗過程中，切勿使乙醇(酒精)乙醚、丙酮等易燃藥品接近火焰。如遇火險，應先關掉火源，再用濕布或沙土掩蓋滅火。必要時用滅火器。

7．使用顯微鏡或其他貴重儀器時，要求細心操作，特別愛護。顯微鏡的目鏡在使用前後必須用浸有乙醇(酒精)的透鏡紙擦淨。對消耗材料和藥品等要力求節約，用畢後仍放回原處，嚴禁將藥匙交叉使用。

8．每次實驗完畢後，必須把所用儀器抹淨放妥，將實驗室收拾整齊，擦淨桌面，如有菌液污染桌面或其他地方時，可用3%來蘇爾液或5%石炭酸液覆蓋半小時後擦去，如系芽孢桿菌，應適當延長消毒時間。凡帶菌之工具(如吸管、玻璃刮棒等)在洗滌前須浸泡在3%來蘇爾液中進行消毒。

9．每次實驗需進行培養的材料，應標明自己的組別及處理方法，放於教師指定的地點進行培養。實驗室中的菌種和物品等，未經教師許可，不得攜出室外。

10．每次實驗的結果，應以實事求是的科學態度填入報告表格中，力求簡明準確，認真回答思考題，並及時匯交教師批閲。

11．離開實驗室前將手洗淨，注意關閉門窗、燈、火、煤氣等。

4實驗一微生物學實驗基本知識與準備

一、目的要求

1．瞭解微生物學實驗基本概念，認識微生物學實驗基本材料。

2．熟悉微生物實驗所需各種常用器皿的名稱和規格。

3．學會正確的清洗玻璃器皿的方法和包紮方法，為實驗做準備。

4．熟讀與牢記微生物學實驗規則和安全。

二、實驗原理

為了保證實驗順利進行，要求把實驗所用器皿清洗乾淨，保持滅菌後無菌狀態，需要對培養皿、吸管等進行妥善包紮，試管和三角瓶要做棉塞。清洗方法根據實驗目的、器皿的種類、所盛放的物品、洗淨劑的類別和沾污程度等的不同而有所不同，不同的器皿包紮方法也不同。

三、實驗器材

1．常用的各種玻璃器皿(三角瓶、移液管、試管、吸管、培養皿、玻片)。

2．洗滌工具和去污粉、肥皂、洗滌液。

3．接種工具、棉花、紗布、棉線等。

四、操作步驟(一)玻璃器皿的認識

1．試管：微生物實驗室所用的玻璃試管，根據其大小和用途不同，有下列三種型號：

(1)大試管(約18mm×180mm)：可裝倒平板用的培養基，也可作製備斜面用(需要大量菌體時用)和裝液體培養基用於微生物的振盪培養。

(2)中試管[(13～15)mm×(100～150)mm]：裝液體培養基培養細菌或做斜面用，也可用於細菌、黴菌、病毒等的稀釋和血清學試驗。

(3)小試管[(10～12)mm×100mm]：一般用於糖發酵或血清學試驗，和其它需要節省材料的試驗。

2．德漢氏小管

觀察細菌在糖發酵培養基內是否產氣時，在小試管內倒置一小套管(約6mm×36mm)(圖1)，此小套管即德漢氏小管，又稱發酵小倒管。

3．小塑料離心管

　　實驗一、實驗室和人體表面微生物的檢查

一實驗目的

1證明實驗室環境與體表存在微生物

2比較來自不同場所與不同條件下細菌的數量和類型

3體會無菌操作的重要性

二實驗原理

平板培養基含有細菌生長所需要的營養成分，當取自不同來源的樣品接種於培養基上，在適宜温度下培養，1-2d內每一菌體能通過很多次細胞分裂而進行繁殖，形成一個可見的細胞羣體的集落，稱為菌落。每一種細菌所形成的菌落都有它自己的特點，例如菌落的大小、表面乾燥或濕潤、隆起或扁平、粗糙或光滑等。因此可通過平板培養基來檢查環境中微生物的數量和類型。

三、器材

1、培養基牛肉膏蛋白腖瓊脂平板

2、儀器或其他用具無菌水、滅菌棉籤（裝在試管內），接種環，試管架，酒精燈，記號筆，廢物缸。

四、操作步驟

1、寫標籤

任何一個實驗，在動手操作前均需首先將器皿用記號筆做上記號（包括班級、姓名、日期、樣品來源等），字儘量小些，寫在皿底的一邊，不要寫在當中，以免影響觀察結果。

注：培養皿的記號一般寫在皿底上，如果寫在皿蓋上，同時觀察兩個以上培養皿的結果，打開皿蓋時容易混淆。

2、實驗室細菌檢查

（1）空氣

將一個肉膏蛋白腖瓊脂平板放在實驗台上，移去皿蓋，使瓊脂培養基表面暴露在空氣中，將另一塊肉膏蛋白腖瓊脂平板放在潔淨工作台內或無人走動的實驗室中，移去皿蓋，1h後蓋上兩個皿蓋。

（2）實驗台

①用記號筆在皿底外面中央畫一直線，再在此線中間處畫一垂直線。

②取棉籤

左手拿含有棉籤的試管，在火焰旁用右手的手掌邊緣和小指、無名指夾持棉塞，將其取出，將管口很快地通過酒精燈的火焰，燒灼管口；輕輕地傾斜試管，用右手的拇指和食指將棉籤小心地取出。放回棉塞，並將空試管放在試管架上。

③弄濕棉籤

左手取滅菌水試管，如上法拔出棉塞並燒灼管口，將棉籤插入水中，再提出水面，在管壁上擠壓一下以除去過多的水分，小心將棉籤取出，燒灼管口，放回棉塞，並將滅菌水試管放在試管架上。

④取樣將濕棉籤在實驗枱面或門旋鈕上擦拭約2cm2的範圍。

⑤接種在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿開啟成一縫。再將棉籤伸入，在瓊脂表面頂端接種（滾動一下），立即閉合皿蓋。將原放棉籤的空試管拔出棉塞，燒灼管口，插入用過的棉籤，將試管放回試管架。

⑥劃線

另取接種環在火焰上滅菌，先將環端燒熱，然後將接種環提起垂直放在火焰上，以使火焰接觸金屬絲的範圍廣一些，待接種環燒紅，再將接種環斜放，沿環向上，燒至可能碰到培養皿的部分，再移向環端，如此很快地來回通過火焰數次。

左手拿起平板，同樣開啟一縫，將滅過菌並冷卻了的接種環（可在瓊脂表面邊緣空白處試温度，若發出濺潑聲，表示太燙），通過瓊脂頂端的接種區，向下劃線，直到平板的一半處。注意：接種環與瓊脂表面的角度要小，移動的壓力不能太大，否則會刺破瓊脂。

閉合皿蓋，左手將平板向左轉動至空白處，右手拿的接種環再在火焰上燒灼，使冷。接種環通過前面劃的線條再在瓊脂的另一半，從上向下來回劃線至1／2處。

燒灼接種環，轉動平板，劃最後1／4，立刻蓋上皿蓋，燒灼接種環，放回原處。

整個劃線操作均要求無菌操作，即靠近火焰，而且動作要快。

3、人體細菌的檢查

（1）手指（洗手前與洗手後）

（2）鼻腔按照實驗台檢查法的步驟②，取出棉籤，並將其弄濕。用濕棉籤在鼻腔內滾動數次，按實驗台檢查法的步驟⑤和⑥接種與劃線，然後蓋上皿蓋。

4、將所有的瓊脂平板翻轉，使皿底朝上，放37℃培養箱，培養1-2d

5、結果記錄方法

（1）菌落計數在劃線的平板上，如果菌落很多而重疊，則數平板最後1/4面積內的菌落數，不是劃線的平板，也一分為四，數1/4面積的菌落數。

（2）根據菌落大小、形狀、高度、乾濕等特徵觀察不同的菌落類型。

菌落特徵：大小、顏色、乾濕情況、形態、高度、透明程度、邊緣。

菌落特徵描寫方法如下：

①大小大、中、小、針尖狀。可先將整個平板上的菌落粗略觀察一下，再決定大、中、小的標準，或由教師指出一個大小範圍。

②顏色黃色、金黃色、灰色、乳白色、紅色、粉紅色等。

③乾濕情況乾燥、濕潤、粘稠。

④形態圓形、不規則等。（e）高度扁平、隆起、凹下。

⑤透明程度透明、半透明、不透明。

⑥邊緣整齊、不整齊。

五、實驗報告

P13：結果1、思考題3、4

1、比較各種來源的樣品，哪一種樣品的平板菌落數與菌落類型最多？

2、人多的實驗室與無菌室（或無人走動的實驗室）相比，平板上的菌落數與菌落類型有什麼區別？你能解釋一下造成這種區別的原因嗎？

3、通過本次實驗，在防止培養物的污染與防止細菌的擴散方面，你學到些什麼？有什麼體會？

六、實驗總結

　　實驗二、細菌簡單染色和普通光學顯微油鏡的使用和細菌形態觀察

一、目的要求

1．學習微生物塗片、染色的'基本技術，掌握細菌的單染色方法及無菌操作技術。

2．熟悉普通光學顯微鏡的構造及各部分的功能。

3．學習並掌握油鏡的原理和使用方法。

二、油鏡物鏡的基本原理

微生物學研究用的顯微鏡的物鏡通常有低倍物鏡（16mm，10×）、高倍物鏡（4mm，40～45×）和油鏡（1.8mm，95～100×）三種。油鏡通常標有黑圈或紅圈，也有的以“OI（oilimmer-sion）字樣表示，它是三者中放大倍數最大的。根據使用不同放大倍數的目鏡，可使被檢物體放大1000～2000多倍。油鏡的焦距和工作距離（標本在焦點上看得最清晰時，物鏡與樣品之間的距離）最短，光圈則開得最大，因此，在使用油鏡觀察時，鏡頭離標本十分近，需特別小心。使用時，油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與物鏡之間不是隔一層空氣，而是隔一層油質，稱為油浸系。這種油常選用香柏油，因香柏油的折射率n=1.52，與玻璃相同。當光線通過載玻片後，可直接通過香柏油進入物鏡而不發生折射。如果玻片與物鏡之間的介質為空氣，則稱為乾燥系，當光線通過玻片後，受到折射發生散射現象，進入物鏡的光線顯然減少，這樣就減低了視野的照明度。

利用油鏡不但能增加照明度，更主要的是能增加數值孔徑，因為顯微鏡的放大效能是由其數值孔徑決定的。所謂數值孔徑，即光線投射到物鏡上的最大角度（稱為鏡口角）的一半正弦，乘上玻片與物鏡間介質的折射率所得的乘積，可用下列公式表示：

NA＝n·sinα式中NA=數值孔徑；n=介質折射率；α=最大入射角的半數，即鏡口角的半數。因此，光線投射到物鏡的角度愈大，顯微鏡的效能就愈大，該角度的大小決定於物鏡的直徑和焦距。

所謂單染色法是利用單一染料對細菌進行染色的一種方法。此法操作簡便，適用於菌體一般形態的觀察。在中性、鹼性或弱酸性溶液中，細菌細胞通常帶負電荷，所以常用鹼性染料進行染色。鹼性染料並不是鹼，和其他染料一樣是一種鹽，電離時染料離子帶正電，易與帶負電荷的細菌結合而使細菌着色。例如，美藍（亞甲藍）實際上是氯化亞甲藍鹽（methylenebluechloride，縮寫為MBC），它可被電離成正、負離子：MBC→methyleneblue++chloride-帶正電荷的染料離子可使細菌細胞染成藍色。常用的鹼性染料除美藍外，還有結晶紫（crystalviolet）、鹼性復紅（basicfu-chsin）、番紅（又稱沙黃，safranine）等。細菌體積小，較透明，如未經染色常不易識別，而經着色後，與背景形成鮮明的對比，使易於在顯微鏡下進行觀察。

三、器材顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環，香柏油，二甲苯，擦鏡紙，生理鹽水；結晶紫染色液，鹼性復紅染色液；金黃色葡萄球菌，大腸桿菌。

四、操作步驟

1、塗片

取兩塊乾淨的載玻片，各滴一小滴生理鹽水於載玻片中央，用無菌操作（參照實驗一），分別挑取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌於二載玻片的水滴中（每一種菌制一片），調勻並塗成薄膜。注意滴生理鹽水時不宜過多，塗片必須均勻。

2、乾燥於室温中自然乾燥。

3、固定塗片面向上，於火焰上通過2—3次，使細胞質凝固，以固定細菌的形態，並使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否則細菌形態將毀壞。

4、染色放標本於水平位置，分別滴加染色液於塗片薄膜上，染色時間長短隨不同染色液而定。結晶紫染色液染2—3分鐘，石炭酸復紅染色液約染1—2分鐘。

5、水洗

染色時間到後，用自來水沖洗，直至衝下之水無色時為止。注意沖洗水流不宜過急，過大，水由玻片上端流下，避免直接衝在塗片處。沖洗後，將標本晾乾或用吹風機吹乾，待完全乾燥後才可置油鏡下觀察。

6、鏡檢

（1）、低倍鏡觀察

（2）、高倍鏡觀察

（3）、油鏡觀察

①用粗調節器將鏡筒提起約2cm，將油鏡轉至正下方。

②在玻片標本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。

③從側面注視，用粗調節器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在香柏油中，其鏡頭幾乎與標本相接，應特別注意不能壓在標本上，更不可用力過猛，否則不僅壓碎玻片，也會損壞鏡頭。④從接目鏡內觀察，進一步調節光線，使光線明亮，再用粗調節器將鏡筒徐徐上升，直至視野出現物像為止，然後用細調節器校正焦距。如油鏡已離開油麪而仍未見物像，必須再從側面觀察，將油鏡降下，重複操作至物像看清為止。

用同樣的方法觀察枯草芽孢桿菌染色標本。

⑤觀察完畢，上旋鏡筒。先用擦鏡紙拭去鏡頭上的油，然後用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶於二甲苯）擦去鏡頭上殘留油跡，最後再用乾淨擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。切忌用手或其他紙擦鏡頭，以免損壞鏡頭。用綢布擦淨顯微鏡的金屬部件。

⑥將各部分還原，反光鏡垂直於鏡座，將接物鏡轉成八字形，再向下旋。同時把聚光鏡降下，以免接物鏡與聚光鏡發生碰撞危險。

五、實驗報告

1．結果：繪出你所觀察到的經單染色的兩種細菌形態圖。（註明物鏡放大倍數和總放大率）

2．思考題

P18思考題1、P28思考題2、3

（1）根據實驗體會，你認為製備染色標本時，應注意哪些事項？

（2）製片為什麼要完全乾燥後才能用油鏡觀察？

（3）在明視野顯微鏡下，觀察細菌形態時，你認為用染色標本好，還是用未染色的活標本好，為什麼？

使用油鏡按下列步驟操作：

1、先用粗調節旋鈕將鏡筒提升（或將載物台下降）約2cm，並將高倍鏡轉出。

2、在玻片標本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。

3、從側面注視，用粗調節旋鈕將載物台緩緩地上升，（或鏡筒下降），使油浸物鏡浸入香柏油中，使鏡頭幾乎與標本接觸。

4、從接目鏡內觀察，放大視場光闌及聚光鏡上的虹彩光圈（帶視場光闌油鏡開大視場光闌），上調聚光器，使光線充分照明。用粗調節旋鈕將載物台徐徐下降（或鏡筒上升），當出現物像一閃後改用細調節旋鈕調至最清晰為止。如油鏡已離開油麪而仍未見到物象，必須再從側面觀察，重複上述操作。

5、觀察完畢，下降載物台，將油鏡頭轉出，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，再用擦鏡紙蘸少許乙醚酒精混合液（乙醚2份，純酒精3份）或二甲苯，擦去鏡頭上殘留油跡，最後再用擦鏡紙擦拭2—3下即可，（注意向一個方向擦拭）。

6、將各部分還原，轉動物鏡轉換器，使物鏡頭不與載物台通光孔相對，而是成八字形位置，再將鏡筒下降至最低，降下聚光器，反光鏡與聚光器垂直，用一個乾淨手帕將接目鏡罩好，以免目鏡頭沾污灰塵。最後用柔軟紗布清潔載物台等機械部分，然後將顯微鏡放回櫃內或鏡箱中。

六、實驗總結

　　實驗三、細菌的革蘭氏染色

一、目的要求

瞭解革蘭氏染色的原理，學習並掌握革蘭氏染色的方法。

二、基本原理

革蘭氏染色反應是細菌分類和鑑定的重要性狀。它是1884年由丹麥醫師Gram創立的。革蘭氏染色法（Gramstain）不僅能觀察到細菌的形態而且還可將所有細菌區分為兩大類：染色反應呈藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌，用G+表示；染色反應呈紅色（復染顏色）的稱為革蘭氏陰性細菌，用G-表示。

三、器材

大腸桿菌，金黃色葡萄球菌；草酸銨結晶紫，番水水溶液，碘液，95%乙醇，載玻片，顯微鏡等。

四、操作步驟

1．塗片將培養24小時的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別作塗片（注意塗片切不可過於濃厚），乾燥、固定。固定時通過火焰1～2次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。

2．染色

（1）初染加草酸銨結晶紫一滴，約一分鐘，水洗。

（2）媒染滴加碘液衝去殘水，並覆蓋約一分鐘，水洗。

（3）脱色將載玻片上面的水甩淨，並襯以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現紫色時為止，約20～30秒鐘，立即用水衝淨酒精。

（4）復染用番紅液染1～2分鐘，水洗。

（5）鏡檢乾燥後，置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。以分散開的細菌的革蘭氏染色反應為準，過於密集的細菌，常常呈假陽性。

（6）同法在一載玻片上以大腸桿菌與金黃色葡萄球菌混合製片，作革蘭氏染色對比。

革蘭氏染色的關鍵在於嚴格掌握酒精脱色程度，如脱色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌；而脱色不夠時，陰性菌可被誤染為陽性菌。此外，菌齡也影響染色結果，如陽性菌培養時間過長，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應。

五、實驗報告

1．結果

在你所作的革蘭氏染色製片中，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌各染成何色？它們是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽性菌

2．思考題

P30思考題1、2、4

（1）作革蘭氏染色塗片為什麼不能過於濃厚？其染色成敗的關鍵一步是什麼？

（2）當你對一株未知菌進行革蘭氏染色時，怎樣能確證你的染色技術操作正確，結果可靠？

六、實驗總結

20**級製藥專業工業微生物學實驗報告

姓名:劉甜甜學號:20**304090

班級:製藥**-2班指導老師：王健

日期：20**.6.11