微生物驗證3篇

　　微生物驗證篇一：微生物驗證方案

1.適用範圍

本方案適用於本公司各品種微生物限度檢驗方法的驗證。

2.目的

通過驗證確認所採用的方法適合於該藥品的微生物限度的測定。

3.職責

項目責任人：負責驗證方案的起草及具體實施。

驗證管理員：負責驗證工作的組織、協調及管理。

QA現場監控員：負責驗證實施過程中的監督檢查，取樣，確保結果的可靠性。

QC負責人：負責驗證方案中檢驗方法的審核及按照規定的取樣計劃對標準檢驗操作程序的準確執

行，負責組織實施。

QC檢驗員：負責驗證方案的起草與參與實施，並對所測數據準確性負責。

質量部經理：負責驗證方案及報告的審核和批准。

4.內容

4.1.概述

通過驗證以確認所採用的方法適合於該藥品的細菌、黴菌及酵母菌的測定；確認所採用的方法適合於該藥品的控制菌的檢查。根據樣品特性制訂檢驗方法和檢驗條件，按制定的方法進行試驗，根據驗證結果判斷是否符合驗證標準。若符合，按驗證的方法和條件進行藥品的微生物限度檢查；若不符合，重新建

立制訂檢驗方法和檢驗條件，再進行驗證，直至驗證結果符合設立的驗證標準。

4.2細菌、黴菌及酵母菌計數方法的驗證

當建立藥品的微生物限度檢查時，應進行細菌、黴菌及酵母菌計數方法的驗證，以確認所採用的方法適合於該藥品的細菌、黴菌及酵母菌的測定。.驗證試驗可與供試品的細菌、黴菌及酵母菌計數同時進行。

4.2.1.驗證用菌株及菌種要求

大腸埃希菌【CMCC（B）44102】、金黃色葡萄球菌【CMCC（B）26003】、枯草芽孢桿菌【CMCC（B）63501】、黑麴黴【CMCC（F）98003】、白色念珠菌【CMCC（F）98001】。

大腸埃希菌為革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，枯草芽孢桿菌為產芽孢桿菌，前述菌株作為細菌計數驗證用菌株；黑麴黴為黴菌，白色念珠菌為酵母菌，作為黴菌及酵母菌計數驗證用菌株。

驗證實驗所用的菌株傳代次數不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍乾燥菌種為0代），並採

用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。

4.2.2.驗證菌菌液製備

.大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液製備：接種大腸埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至10ml營養瓊脂培養基中，35～37℃培養18～24小時。取此培養液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，採用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6~10-7，製成每1ml含菌數50～100cfu

的菌懸液。

.白色念珠菌菌液製備：接種白色念珠菌的新鮮培養物至10ml改良馬丁培養基中，23～28℃培養24～48小時；取此培養液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，採用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6~

10-7，製成每1ml含菌數50～100cfu的菌懸液。

.接種黑麴黴的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，23～28℃培養5～7天，加入3～5ml0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脱，吸至無菌試管內，取1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，採用10倍

遞增稀釋法，稀釋至10-4~10-6，製成每1ml含孢子數50～100cfu的孢子懸液。

4.2.3.供試液的製備

.無抑菌活性的供試品供試液的製備

◆稀釋劑：pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液

◆液體供試品：供試品10ml置錐形瓶中，加入90ml稀釋劑，混勻，作為供試液（1：10）。

◆固體、半固體、粘稠性供試品供試品：稱取供試品10g置錐形瓶中，加稀釋劑至100ml，混勻後，

作為供試液（1：10）。

.具有抑菌活性的供試品供試液的製備

當供試品具有抑菌活性時，須先消除抑菌活性，其方法如下：

◆培養基稀釋法：取供試液2ml，每0.2ml的供試液注一皿或每0.1ml的供試液注一皿；或取供試液1ml每0.5ml的供試液注一皿，傾注15ml的培養基，測定細菌、黴菌及酵母菌的菌數，混勻，凝固，培養。每1ml供試液所注的平皿生長的菌數之和即為1ml的菌落數。計算每1ml供試液的平均菌落數，

按平皿法計數規則報告菌數；控制菌檢查時可加大增菌液的用量。

◆離心沉澱集菌法：取一定量的供試液，3000轉/分離心20分鐘（供試液如有沉澱，先以500轉/分鐘離心5分鐘，取全部上清液再離心），棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補至原量。

◆薄膜過濾法：取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，按薄膜過濾法測定其菌落

數。

◆中和法：選取適宜的中和劑如磺胺類藥物加入適當的對氨基苯甲酸，含重金屬的藥物在培養基內加入巰基化合物如硫乙醇酸鈉-半胱氨酸，洗必泰製劑加入聚山梨酸80（3%）或卵磷脂（3%），鹵素中

加入硫代硫酸鈉（0.1%）等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性後測定。

4.2.4.菌液組測定所加的試驗菌數。採用平皿法，取試驗用的1ml菌液（約50～100cfu）分別注入平皿中，立即傾入培養基，每株試驗菌平行製備2個平皿，按平皿法測定其菌落數。

4.2.5.試驗組

.平皿法：取試驗可能用的最低稀釋級1ml供試液和50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，

立即傾入培養基，每株試驗菌平行製備2個平皿，按平皿法測定其菌落數。

.培養基稀釋法（平皿法）：取試驗可能用的最低稀釋級1ml供試液分別注入N個平皿中，每個平皿再注入50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養基，每株試驗菌平行製備2個平皿，

按平皿法測定其菌落數。

薄膜過濾法：取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最後一次的沖洗液

中加入50～100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌落數。至少要一張膜。

.離心沉澱集菌法：取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉/分鐘離心3~5分鐘，取全部上清液，再以3000轉/分離心20分鐘，取下面1ml液體，並用稀釋劑

洗滌管底，將洗滌液與1ml液體一起採用平皿法或薄膜過濾法計數。

4.2.6.供試品對照組

取規定量供試液，按菌落計數方法測定供試品本底菌數（方法和試驗組相同）。

4.2.7.稀釋劑對照組

若供試液需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾法等處理時，應增加稀釋劑對照組，用稀釋劑代替供試品，加入試驗菌，使最終濃度為每1ml供試液含50～100cfu，按試驗組的供試液製備方法和計數

方法計數。

4.2.8.回收率計算

.試驗組回收率計算

試驗組的菌回收率＝試驗組的菌回收率—供試品對照組平均菌落數×100%

菌液組的平均菌落數

.稀釋劑對照組回收率計算

試驗組的菌回收率＝稀釋劑對照組平均菌落數×100%

菌液組的平均菌落數

計數方法驗證至少應進行3次獨立平行試驗，並分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。

4.2.8.結果判斷

在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數佔菌液組的平均菌落數的百分率）≥70%。若試驗組的菌回收率（試驗組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數佔菌液組的平均菌落數的百分率）≥70%。照該供試液製備方法和計數法測定供試品的細菌、黴菌及酵母菌數；若任一次試驗中試驗組的菌回收率低於70%，應採用自然沉降法、培養基稀釋法、離心沉澱集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，並重新進行方法驗證，使試驗組菌回收率大於70%。

4.3.控制菌檢驗方法驗證

當建立藥品的微生物限度檢查時，應進行控制菌檢查方法的驗證，以確認所採用的方法適合於該藥品的的控制菌檢查方法測定。若藥品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時，檢驗方法應進行

重新驗證。驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進行。

4.3.1.驗證用菌株

大腸埃希菌（Esherichiacoli）【CMCC(B)44102】、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus）【CMCC(B)003】、乙型付傷寒沙門菌（SalmonellaparatyphiB）【CMCC(B)50094】、銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）【CMCC(B)10104】

驗證實驗所用的菌株傳代次數不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍乾燥菌種為0代），並採用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。

4.3.2.菌液製備

大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型付傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物至10ml營養肉湯培養基中，35～37℃培養18～24小時；分別取培養液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液，採用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5~10-7，製成每1ml含菌數10～100cfu的菌懸液。

4.3.3.陰性菌對照組設立陰性菌對照組是為了驗證該控制菌檢查方法的專屬性。方法同試驗組，驗證大腸埃希菌、大腸菌羣、沙門菌檢查法時的陰性對照菌採用金黃色葡萄球菌；驗證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法時的陰性對照菌採用大腸埃希菌。陰性對照菌不得檢出。

4.3.4.試驗組

.常規法

◆大腸埃希菌取相當於1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養基中，陽性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養18～24小時，取此培養物按《微生物限度檢查SOP》大腸埃希菌項下規定檢查。

◆大腸菌羣取含適量（不少於10ml）的`膽鹽乳糖發酵培養基管3支，分別加入含供試品1g或1ml、0.1g或0.1ml、含供試品0.001g或0.001ml的供試液，陽性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養18～24小時，按《微生物限度檢查SOP》大腸菌羣項下規定檢查。

◆沙門菌取供試品10g或10ml，直接或處理後接種至適量（不少於200ml）的營養肉湯培養基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，陽性菌對照加入沙門菌10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養18～24小時。按《微生物限度檢查SOP》沙門菌項下規定檢查。

◆銅綠假單胞菌取相當於1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養基中，陽性菌對照加入銅綠假單胞菌10～100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，35～37℃培養18～24小時。按《微生物限度檢查SOP》沙門菌項下規定檢查。

◆金黃色葡萄球菌取相當於1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養基中，陽性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，35～37℃培養18～24小時。

按《微生物限度檢查SOP》金黃色葡萄球菌項下規定檢查。

.培養基稀釋法供試品有抑菌作用，放大培養基量，由1：100放大到1：300、1：500或1：1000，由於容器體積限制，一般放大到500ml或1000ml，本法適用於抑菌作用不強的樣品。

.薄膜過濾法採用薄膜過濾法時，取規定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應加在最後一次沖洗液中，過濾後，注入培養基或取出濾膜接入增菌培養基中。

.離心沉澱集菌法取規定量供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉/分鐘離心3~5分鐘，取全部上清液，再以3000轉/分離心20分鐘，取下面1ml液體，並將適量的稀釋劑洗滌管底的洗滌液一併移入同瓶增菌液中，培養，本法適用於中度抑菌作用的樣品。

.中和法在供試品溶液中加入相應的中和劑，以減除供試品中抑菌成分的作用，中和劑應對微生物無毒性，與抑菌成分結合後的產物應對微生物亦無毒性，或有毒性但不影響待檢菌的檢出。

4.3.5.結果判斷

至少應進行3次獨立平行試驗。陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。若試驗組檢出試驗菌，照該供試液製備方法和控制菌檢查法進行該供試品控制菌的檢查；若試驗組未檢出試驗菌，應採用自然沉降法、培養基稀釋法、離心沉澱集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，並重新進行方法驗證。

5.驗證的實施

5.1細菌、黴菌及酵母菌計數方法驗證記錄及控制菌檢驗方法驗證記錄(見附件)。

5.2.分析數據，綜合整個驗證過程，得出驗證結論。

5.3.驗證過程中發生的異常情況，按照《偏差處理程序》進行處理。

6.相關文件

《微生物限度檢查SOP》

　　微生物驗證篇二：微生物方法學驗證範本

XXXX軟膏微生物限度檢查方法學驗證方案

1.驗證目的XXXX軟膏配方中含水楊酸、硼酸，該兩種物質具有一定的抑菌性。根據《中國藥典》（2005年版）微生物限度檢查標準規定，對XXXX軟膏進行細菌、黴菌及酵母菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌檢查方法的驗證試驗，以確認供試品的抑菌活性及測定方法的可靠性。

2.驗證範圍本公司XXXX軟膏的微生物限度檢測。

3.判定標準

3.1驗證小組成員

3.2細菌、黴菌及酵母菌在3次平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數佔菌液組的平均菌落數的百分率）應均不低於70%，試驗組的菌回收率（試驗組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數的值佔菌液組的平均菌落數的百分率）均不低於70%；產品的試驗組與陽性菌組的菌落數差異不超過30%，假定產品試驗組的平均值與陽性菌組的平均值之比為Q，則0.7≤Q≤1.3。

3.3金黃色葡萄球菌在3次平行試驗中，供試品組：結果應為陰性，未檢出金黃色葡萄球菌；試驗組：結果應為陽性，檢出金黃色葡萄球菌；陰性對照組：結果應為陰性，未檢出陰性對照菌；陽性對照組：結果應為陽性，檢出金黃色葡萄球菌。

3.4銅綠假單胞菌在3次平行試驗中，供試品組：結果應為陰性，未檢出銅綠假單胞菌；試驗組：結果應為陽性，檢出銅綠假單胞菌；陰性對照組：結果應為陰性，未檢出陰性對照菌；陽性對照組：結果應為陽性，檢出銅綠假單胞菌。

4.驗證方法

4.1.試驗原料、稀釋劑和標準微生物

4.1.1試驗樣品：XXXX軟膏三批，批號為、、。

4.1.2稀釋劑：PH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液。配法：照（05版藥典附錄XIIIC）配製；0.9%無菌氯化鈉溶液的配製：取氯化鈉9.0g，加1000ml使完全溶解，分裝，滅菌。4.1.3實驗儀器：無菌培養皿（直徑9.0cm）、淨化室、滅菌鍋、無菌刻度吸管（10ml、1ml）,水浴鍋，試管（18×180）,具塞三角瓶。

4.1.4驗證用培養基營養瓊脂培養基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基、溴化十六烷基三甲銨培養基、玫瑰紅鈉培養基。

4.1.5驗證用微生物名稱及編號

4.1.6菌液製備接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中培養18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂培養基中，培養24～48小時；上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml含菌數為50～100cfu的菌懸液。4.1.7供試品溶液的製備稱取XXXX軟膏10g，置滅菌三角瓶中，加入PH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液至100ml，45℃下使之全部溶化，搖勻，作為1：10的供試品溶液。4.2細菌、黴菌及酵母菌驗證內容

4.2.1試驗組：分別取1:10供試品

溶液0.2ml注入兩個平皿，接種50-100個挑戰微生物，每株試驗菌平兩行製備兩個平皿（分別注入以上四種菌懸液），向平皿內倒冷卻至45℃的營養瓊脂培養基（細菌）或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基（白色念珠菌黴）15～20ml：並混合均勻凝固後，置於所需温度下培養。

4.2.2菌液組：不加供試液，直接將試驗菌株接種於2個平皿中，其餘操作步驟同樣品試驗組操作。

4.2.3供試品對照組：取1:10供試品溶液0.2ml分別注入兩個平皿，向平皿內倒冷卻到45℃的營養瓊脂培養基（細菌）或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基（白色念珠菌黴）15～20ml,並混合均勻凝固後，置於所需温度下培養。

4.2.4上述操作，應做三次平行試驗，分別計算各次試驗的菌的回收率。

試驗組的菌回收率=[(試驗組平均菌落數－供試品對照組平均菌落數)/菌液組平均菌落數]×100%。

4.2.5培養：營養瓊脂培養基平皿倒置於30-35℃下培養48h，玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出

　　微生物驗證篇三：微生物限度檢測方法驗證

概述

1.1試驗背景

為保證微生物限度檢驗結果的準確可靠，當建立產品的微生物限度檢查法時，應進行方法的試驗，以確認供試品在該實驗條件下無抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不計，所採用的方法適合於該產品的微生物限度檢查。按照《中國藥典》2015年版要求，檢驗程序或產品發生變化可能影響檢驗結果時，檢查方法應進行重新試驗。

根據15年版藥典及藥品微生物實驗室質量管理指導原則要求，檢測環境由原來的為C級背景下局部A級空氣單向流，變更為在C級背景下，生物安全櫃中進行微生物限度檢測,試驗用菌株有原來的大腸埃希菌變更為銅綠假單胞菌、接種用培養基隨之發生變化；實驗組及對照組製備發生變更。現針對純化水微生物限度試驗方法確認，以證明所採用的方法適合該藥品的微生物限度檢查。

1.2方案説明

驗證過程中嚴格按照經批准的方案規定的內容進行，若因特殊原因需要變更時，應填寫方案變更申請及批准書（附件1），報驗證領導小組批准。

2.試驗目的及要求

按照《中國藥典》2015年版規定對純化水微生物限度檢查方法進行試驗，在現有檢驗程序、檢測條件及培養條件下，通過試驗以確認所採用的方法適合於純化水需氧菌的測定；根據樣品特性制訂檢驗方法和檢驗條件，按制定的方法進行試驗，根據試驗結果判斷是否符合試驗標準。

3.試驗小組

4.風險分析:

4.1風險等級標準

A、嚴重程度（S）：測定風險的潛在後果，主要針對可能危害產品質量、患者健康及數據完整性的影響，分為以下四級：

B、可能性程度(P)：測定風險產生的可能性，為建立統一基線，建立以下四個等級：

C、檢測能力（D）:在潛在風險造成危害前，檢測發現的可能性，設為以下四個等級：

4.2風險評估：根據確定的風險標準對已經識別並分析的風險進行評價，即通過評價風險的嚴重性和可能性從而確認風險的等級。質量風險優先級別評價標準如下：

風險優先係數（RPN）計算：嚴重程度（S）×可能性程度(P)×檢測能力（D）。

4.2.1風險識別

1)產品組分或組成發生改變2)檢驗程序與檢驗條件發生改變

3)產品存在抗菌活性，抗菌活性的去除影響微生物的生長4)微生物檢驗用物料影響檢驗結果4.2.2風險分析及評價

4.3依據風險分析及評價結果需實施的確認項目

5.試驗前準備

5.1文件確認

5.2.儀器確認：·

5.2.1確認檢測設備已經檢定並在有效期內使用。5.2.2確認檢測設備運行良好，且滿足檢測需要。

5.3培養基和沖洗液的確認

5.3.1確認培養基是否在有效期內使用5.3.2確認培養基儲存條件、性狀符合要求。

5.4試驗用菌株及菌種要求

6.試驗步驟

6.1.需氧菌計數

6.1.1.菌液製備

1）銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌液製備：接種銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌工作用菌種1白金耳接種至10ml胰酪大豆腖液體培養基中，30～35℃培養18～24小時。取該新鮮培養液1ml加入至0.9%無菌氯化鈉溶液中（規格：9ml/支），10倍梯度稀釋至10～10，製成每1ml含菌數不大於100cfu的菌懸液。試驗步驟：

6.1.2.供試液的製備

供試品：純化水儲存條件：；

取樣點1：；取樣點2：；取樣點3：；稀釋劑：0.1%蛋白腖水溶液方法：試驗組：

A）滅菌吸管吸取5ml供試品加入電動吸引器濾杯中，加入無菌0.1%蛋白腖水溶液50ml進

行過濾，濾幹後，將薄膜用鑷子夾到已凝固的R2A瓊脂培養基上。每個樣品做兩個平行樣。

B）供試品對照組：取製備好的供試液,以稀釋液代替菌液同試驗組操作。

C）菌液對照組：取不含中和劑及滅活劑的相應稀釋液替代供試液,按試驗組操作加入試驗菌液並進行微生物回收試驗。

D）計數方法適用性試驗進行3次獨立平行試驗（分別使用不同取樣點的純化水），並分別計算各試驗菌每次回收試驗的比值。可接受標準：

試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值應在0.5～2範圍內。

計數結果（CFU/皿）：